ELISA Cihazı okuyucu nasıl çalışır?
Bir ELISA okuyucu plakanın 12 kuyucuğundaki renk farklılıklarını ölçer ve niceliğini belirler . ELISA okuyucuları veya mikro plaka okuyucuları spektrofotometri yapar; Bir dalga boyunda ışık yayarlar ve protein gibi bir nesne tarafından emilen ve yansıtılan ışık miktarını ölçerler.
Elisa Cihazı okuyucu, bilim adamlarının bir çözelti içindeki antijenlerin ve antikorların reaksiyonlarını enzim aktivitesi yoluyla ölçmelerine olanak tanıyan özel bir spektrofotometredir (spektrumun bir kısmı boyunca ışığın yoğunluğunu ölçen bir aparat).
Bir ELISA birden fazla adımdan oluşur. Bu adımların çoğu, spesifik olmayan bağlanmayı önlemek amacıyla bloke etme ve yıkama adımlarıdır. Spesifik olmayan bağlanma, proteinler hedef dışı etkileşimler yoluyla birbirine veya ELISA plakasının plastik yüzeyine adsorbe olduğunda meydana gelir. Kesin ELISA adımları yöntemler arasında biraz farklılık gösterir. Ancak burada örnek olarak sandviç ELISA’ya odaklanacağız .
ELISA okucu adımları, prensibi ve nasıl çalıştığı kısaca bahsedelim
ELISA (Enzim Bağlantılı İmmünSorbent Testi) , bir hedef proteinin varlığını tespit etmek için kullanılan altın yıldızlı immünolojik testtir . Araştırma ve geliştirme sırasında tüm yeni test teknolojilerinin karşılaştırıldığı standart prosedürdür . ELISA aynı zamanda hastalığın teşhisine yönelik çoğu klinik testin temelini oluşturur çünkü son derece hassastır ve şu anda en iyi karakterize edilmiş ve standartlaştırılmış yöntemdir.
Antikorlar ELISA plakalarına nasıl yapışır?
Adsorpsiyon, kaplama için kullanılan antikor veya antijen üzerindeki amino asitlerin yan zincirleri ile plastik yüzey arasındaki hidrofobik etkileşimler sonucu pasif olarak gerçekleşir. Kaplama maddesinin konsantrasyonunun yanı sıra zamana, sıcaklığa ve kaplama tamponunun pH’ına bağlıdır.
Sandviç ELISA adımları şunlardır:
Adım 1: Yakalama proteininin immobilizasyonu
Sandviç ELISA’da yakalama proteini bir antikordur ve hedef antijendir. Bu nedenle ilk ELISA adımı, yakalama antikorunu plaka üzerinde hareketsiz hale getirmektir. Yakalama proteininin önceden immobilize edildiği birçok ELISA kiti mevcuttur.
Adım 2: Kuyu yüzeyinden adsorbe edilmemiş yakalama proteinini yıkayın
Deterjanlarla yıkama adımları, proteinler arasındaki hedef dışı hidrofobik etkileşimleri azaltır ve bağlanmamış yakalama proteinlerini plakadan çıkarır.
Adım 3: Plakadaki bağlanmamış siteleri engelleyin
Proteinler arasındaki hidrofobik etkileşimlere yük veya hidrofobiklik aracılık eder. Bu, adımların engellenmesi ve yıkanması yoluyla bunların bir dereceye kadar hafifletilebileceği anlamına gelir.
Plakanın yüzeyindeki açık bölgelere adsorbe olan proteinler plakaya eklenir. Sığır Serum Albümini (BSA), Kazein veya aprotinin gibi proteinler, bir ELISA tahlilinde bloke etmek için yaygın olarak kullanılır.
Bu proteinler plakaya adsorbe edilerek hedef proteinin daha sonra bu bölgelere erişmesini engelleyecektir. Spesifik olmayan bağlanma vakasının bu şekilde azaltılması, arka plan gürültüsünün azalmasına neden olur.
Adım 4: Adsorbe edilmemiş bloke edici proteinleri kuyucuktan yıkayın
İkinci bir yıkama adımı bağlanmamış bloke edici proteinleri ortadan kaldırır.
Adım 5: Numuneyle (serum, idrar, tükürük veya katkılı araştırma solüsyonu) inkübe edin
Bu adımda antikor ve antijen arasındaki spesifik tanıma gerçekleşir . Sandviç ELISA’da antikorlar plakaya adsorbe edilir ve numune sıvısındaki hedef antijene bağlanır. Bu, bağlanma kinetiğinin dengeye ulaşmasını sağlayacak bir inkübasyon adımı gerektirir.
Adım 6: Kuluçka sıvısını yıkayın
Bu, bağlanmamış herhangi bir antijenin yıkanıp uzaklaştırıldığından emin olmak için sıklıkla birden fazla yıkama gerektiren çok önemli bir yıkama adımıdır . Bu adımdan sonra kuyucuklarda kalması gereken tek antijen, antikorları yakalamak için bağlananlardır.
Adım 7: Saptama antikoruyla inkübe edin
Bir ELISA’daki tespit antikoru, bir florofor (florimetri için) veya bir enzim (kolorimetrik tespit veya kemilüminesans için ) gibi belirli bir etikete konjuge edilir. Saptama antikoru, hedef antijen üzerindeki yakalama antikorundan farklı bir epitopu ‘tanır’. Bu nedenle sandviç ELISA analizleri, yakalama antikoru-antijen saptama antikorundan oluşan bir “sandviç” ile sonuçlanır.
Adım 8: Bağlanmamış tespit antikorunu yıkayın
Adım 9: Kimyasal kolorimetrik veya kemilüminesan reaksiyonlar için substrat uygulayın veya floresan reaksiyonlar için gelen ışığı uygulayın ve sinyali ölçün
Kullanılan ELISA yöntemine bağlı olarak, rengin floresans, lüminesans miktarı veya yoğunluğu örnekten ne kadar hedef antijenin yakalandığını gösterir.
ELISA analizleri, kolorimetrik, kemilüminesan veya floresan bir ürün üretmek için enzimle konjuge edilmiş bir etiket ile bir substrat arasındaki enzimatik reaksiyona dayanır. Bu ürünler daha sonra bir spektrofotometre veya florometre aracılığıyla tespit edilir ve ölçülür, böylece numunedeki hedef proteinin konsantrasyonu hakkında bilgi sağlanır.
